一、RNA的提取
（一）试剂准备
1．TRIzol试剂。
2．氯仿
3．异丙醇
4．75%乙醇（DEPC H2O配制）
5．DEPC H2O
Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
TRIzol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
0.1%的8－羟基喹啉，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。
（二）操作步骤
1) 从细胞培养平皿中收集细胞数约为1X107的细胞，加入1ml Trizol。加样枪头反复吹打 混匀，直至细胞全部溶解。
2) 细胞裂解液室温放置5min，按每1ml Trizol试剂用量加入0.2ml氯仿（实际加的是300ul， 理论上Trizol：氯仿最佳比例为5:1，但为了使萃取效果好所以加入300ul的氯仿）氯仿，剧烈振荡10-15s，室温静置15min(室温静置15min是为了让萃取反应完全进行)，4℃ 12000 r/min离心15 min，观察分层。（注：氯仿的作用：一是萃取，二是使蛋白质变性；剧烈振荡的作用：一是使液体充分混匀，二是用机械力破坏DNA；EP管中的液体分三层，上层为水相，中间层为变性的蛋白相，下层为氯仿萃取出的有机相，其中RNA溶解在水相中。）
3) 取上清至新EP管，加入750μl异丙醇（一般Trizol：异丙醇=2:1，但为 了使RNA尽量多的沉淀下来所以加入750ul），（轻微）振荡10-15 s，-20℃静置30min，4℃ 12000 r/min离心8min（可见管底有透明的胶状沉淀）后弃去上清液。（注：异丙醇的作用是使RNA变性。RNA遇有机物变性，遇水复性。-20℃静置30min是因为温度越低、静置时间越长越有利于RNA充分变性。异丙醇的量越多，温度越低，越有利于RNA的沉淀）。
4) 加入1ml预冷的75%乙醇洗涤RNA，轻轻振荡几次后，4℃ 12000r/min 离心5 min，弃去上清液。（注：75%乙醇（洗去异丙醇）除具有洗涤作用外，本身易挥发，便于RNA的干燥）。
5) 干燥，在弃上清液后，保持EP管口向下，在滤纸上尽量吸干管口乙醇， 然后将EP管水平放置，管口朝向酒精灯方向干燥约10min，期间可用加样枪吸干EP管管壁上的液体，注意勿触及管底的RNA。（注：为了更好的控制RNA中盐离子的含量，应尽量除净乙醇，同时注意勿使管底的RNA过分干燥，否则RNA会不容易溶解）。
6) 加入逆转录试剂盒中的DEPC处理水20µl，溶解RNA。用枪反复吹打 后，吸取3µl分装于0.5ml的去RNA酶的管中，用于测RNA的浓度。
（三）注意事项
1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（2）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。
二、RNA检测
凝胶电泳的制备。以小电泳槽为例，配制1%的琼脂糖凝胶20ml。
1) 电子天平上准确称取0.2g琼脂糖，倒入锥形瓶中，加入14 ml 1×TAE电泳缓冲液，置于微波炉中，中火约3min将其完全溶解；
2) 将锥形瓶置于冷水中，使其冷却，待凝胶温度降至约60℃时（不烫手即 可），加入2ml 10×MOPS 、4ml甲醛；加1μl 显色剂EB（10mg/ml），使其终浓度达到0.5μg/ml，微微振荡混匀；
3) 在加热溶解琼脂糖的同时，将胶槽两端的挡板及梳子装好；
4) 将加有EB的琼脂糖倒入已准备好的胶槽中；
5) 室温静置，待琼脂糖凝胶凝固。
RNA样品的处理: 取5μl的总RNA样品于EP管中，加入4μl逆转录试剂盒中的DEPC处理水和1μl 10×RNA上样缓冲溶液溶解RNA，置于90℃热水中加热5min，使RNA变性，冰浴冷却。
电泳及结果的观察: 1）将胶槽置于电泳槽中，小心取出梳子，向电泳槽中加入适量的1×MOPS，使其没过凝胶约5mm；
2）用加样枪将处理过的RNA加入加样孔中；
3）接好电泳槽的电极，接通电源，120V恒压电泳15 min后在紫外透射反射仪上观察 RNA的完整性。
三、测RNA浓度
取1µl总RNA样品在Nanadrop分光光度计中测其浓度。
1) 用DEPC处理水清洗探头3次，加一滴DEPC处理水作为空白对照并调 零。
2) 测量样品的总RNA浓度，每测量完一个样品，需要用DEPC处理水清 洗探头3次。期间记录所测样品的浓度，观察OD260/OD280（R）比值，为1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以允许。当R＜1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，当R＞2.0 时，说明RNA已经水解成为寡核苷酸。 3) 测量结束后用DEPC处理水清洗探头多次，以便下次使用及增加仪器使 用寿命。